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近年來，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)正在給整個科研界帶來革命性變化，該技術(shù)使用 CRISPR 系統(tǒng)將 Cas9 蛋白和向?qū)?RNA 注入小鼠受精卵，就能輕松實現(xiàn)基因敲除，同時，注入 Donor DNA 則可實現(xiàn)基因敲入，甚至學(xué)術(shù)期刊 Genome Biology 有文章指出這項新技術(shù)將很快取代使用胚胎干細(xì)胞的基因修飾，看起來小鼠胚胎干細(xì)胞基因修飾技術(shù)的終結(jié)不可避免。

然而，事實是這樣嗎？

脫靶效應(yīng)仍存爭議

CRISPR/Cas9 這一被稱為 “魔剪” 的基因編輯工具在基因工程應(yīng)用方面被寄予厚望。但是，脫靶效應(yīng)這一有爭議的老問題一直影響著 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的應(yīng)用。有文獻(xiàn)報道，CRISPR/Cas9 的切割是通過 gRNA 與基因組位置之間 20bp 堿基的配對，且配對堿基的 5′ 端需要有 PAM 結(jié)構(gòu)，再引導(dǎo) Cas9 作用實現(xiàn)的，但是 CRISPR/Cas9 與靶位點識別的特異性主要依賴于 gRNA 與靠近 PAM 處 10-12bp 堿基的配對，而其余遠(yuǎn)離 PAM 處 8-10bp 堿基的錯配對靶位點的識別影響不明顯，這項研究直接說明了 CRISPR/Cas9 存在嚴(yán)重的脫靶性，即該技術(shù)可以發(fā)生非特異性切割，引起基因組非靶向位點的突變，這樣會造成研究結(jié)果的不確定性。

去年在 Nature Methods 雜志上發(fā)表的研究 “Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo” 通過全基因組測序分析表明 CRISPR 基因編輯會引入數(shù)百種不可預(yù)估的突變到基因組中，文章所指出的大規(guī)模脫靶問題，對 CRISPR 的應(yīng)用提出了尖銳的挑戰(zhàn)，卻又在今年 3 月 30 日出現(xiàn)反轉(zhuǎn)并進(jìn)行了撤稿處理。值得注意的是，這篇文章的作者 Kellie A Schaefer 和共同作者 Wen-Hsuan Wu 均同意撤稿，而包括通訊作者 Alexander G Bassuk 以及 Vinit B Mahajan 在內(nèi)的其余四位作者則不同意撤稿。這與通常的撤稿情況還是有所不同，一般的撤稿大多數(shù)情況貌似都是通訊作者要撤稿，這篇爭議性文章通訊作者則堅持了自己的意見。顯然，這篇文章在研究者們內(nèi)部也有巨大分歧。

不過，也有研究表明，CRISPR 的脫靶問題并沒那么嚴(yán)重：bioRxiv 期刊上的研究 “Whole genome sequencing of multiple CRISPR-edited mouse lines suggests no excess mutations.” 指出，多個采用 CRISPR/Cas9 技術(shù)基因編輯的小鼠品系經(jīng)過全基因組測序后的結(jié)果顯示，CRISPR/Cas9 技術(shù)可在生物水平上地對基因組進(jìn)行編輯，并沒有引入很多非預(yù)期的脫靶突變。

從以上這些充滿爭議性的研究可以看出，在應(yīng)用 CRISPR/Cas9 技術(shù)時，其脫靶效應(yīng)仍需謹(jǐn)慎考慮。綜合來看，現(xiàn)階段修飾準(zhǔn)確、效果穩(wěn)定、脫靶率極低的 ES 打靶技術(shù)仍是研究者的較優(yōu)選擇。

CRISPR/Cas9 技術(shù)目前難以勝任復(fù)雜的基因編輯

另一方面，對于復(fù)雜的基因修飾（如條件性敲除、條件性點突變和大片段敲入等），CRISPR 有先天不足，因為此時需要 Donor DNA 與受精卵中基因組的特定位置發(fā)生同源重組，而同源重組的效率很低。相反，ES 打靶技術(shù)在這一方面因其 flox 區(qū)域范圍大、對于復(fù)雜結(jié)構(gòu)寬容度高、打靶一次成功率高等特點，會有明顯的優(yōu)勢。

CRISPR/Cas9 專li之爭仍存爭議，商業(yè)化應(yīng)用存在較大隱患

對于 CRISPR/Cas9 技術(shù)，還有一個值得關(guān)注的是其專li使用問題，CRISPR/Cas9 專li是基于多家機構(gòu)的研究成果，產(chǎn)權(quán)不明晰，一直存在所有權(quán)之爭。

2017 年初，Broad 研究所和合作者們被授權(quán)了關(guān)于真核生物細(xì)胞（包括人類細(xì)胞）的基因組編輯的 CRISPR 專li，而加州大學(xué)伯克利分校和合作者授權(quán)的專li是關(guān)于將 CRISPR 技術(shù)用于到 cell-free 系統(tǒng)中，并不是涉及真核細(xì)胞的基因組編輯。然而，后者對這一判決結(jié)果并不滿意，不滿意的結(jié)果就是啟動專li抵觸程序（interference proceeding）。通過該程序一個可以接手另一個的專li。

來自咨詢公司 IPStudies2017 年的數(shù)據(jù)顯示，目前還有 763 項和 Cas9 相關(guān)的專li，在這些專li中，有些聲稱擁有某些 CRISPR/Cas9 基因編輯方面的專li權(quán)，隨著時間過去，這些專li的擁有者或許也會試圖去維護(hù)他們的權(quán)利。

CRISPR 專li的紛爭給一些商業(yè)機構(gòu)帶來了巨大的困惑。 首先，這意味著在未獲得 CRISPR/Cas9 技術(shù)專li授權(quán)的商業(yè)機構(gòu)購買基于 CRISPR/Cas9 技術(shù)提供的技術(shù)服務(wù)和產(chǎn)品，存在著較大的法律風(fēng)險；其次，很難保證從一家專li所有人購買的專li能覆蓋所有應(yīng)用需求。

應(yīng)用 CRISPR/Cas9 技術(shù)發(fā)表的文章數(shù)量和質(zhì)量低于 ES 打靶技術(shù)發(fā)表的文章

通過 Google 學(xué)術(shù)搜 2013 年至今有關(guān) CRISPR/Cas9 基因敲除和 ES 打靶技術(shù)有關(guān)的文章，搜 knockout「embryonic stem cell」 or「ES cell」找到約 17300 條結(jié)果，搜 knockout「crispr」or「cas9」找到約 16100 條結(jié)果。

針對兩個搜結(jié)果，隨機抽檢搜列表中的 100 篇文獻(xiàn)，統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)采用 ES 打靶技術(shù)發(fā)表的文章平均影響因子比 CRISPR/Cas9 技術(shù)發(fā)表的文章高 2.1 IF。因此，不論從文章質(zhì)量還是數(shù)量，目前 CRISPR/Cas9 技術(shù)的影響力仍弱于金標(biāo)準(zhǔn)的 ES 打靶技術(shù)。不過不可因此否認(rèn) CRISPR/Cas9 技術(shù)未來潛在的影響力。

綜合以上幾個方面來看， 近年來一直處于風(fēng)口浪尖的熱點 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)過多次類似的 “危機”，雖然有很多優(yōu)勢，但學(xué)界仍需對其保持冷靜態(tài)度，隨著不同國家、不同地域的研究者們在 CRISPR 領(lǐng)域孜孜探，也許這次一系列事件對 CRISPR 來說并非危機，反而是推動其發(fā)展的重要力量，我們也希望科學(xué)家們可以不斷去探，優(yōu)化工藝，以期將基因組編輯技術(shù)被更廣泛應(yīng)用于臨床的疾病治療。