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常用的蛋白質(zhì)染色試劑分為已考馬斯亮藍(lán)為代表的有機(jī)試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色。其中考馬斯亮藍(lán)染色法的應(yīng)用較為廣泛，現(xiàn)將其與其他的蛋白質(zhì)染色方法(主要是銀染法)作一比較，幫助大家更好地去選擇合適的蛋白質(zhì)染色方法。

蛋白質(zhì)的染色常用的有4類：有機(jī)試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色。

其中有機(jī)試劑染色以考馬斯亮藍(lán)染色法(Coomasie brilliant blue，CBB)為代表，在蛋白質(zhì)分析中常用，但對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的顯現(xiàn)較差;銀染靈敏度雖高，卻常與質(zhì)譜不兼容;熒光染色以SYPRO試劑為主。

蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏度高，能兼容質(zhì)譜，但由于需要配備特殊的檢測(cè)儀器及試劑的昂貴，未被作為常規(guī)方法使用;而同位素顯色則存在安全性和操作局限性等問題。因此，篩選簡(jiǎn)便、節(jié)約、檢測(cè)靈敏度高、質(zhì)譜兼容的蛋白質(zhì)著色法是蛋白質(zhì)組 研究所需。

由于考馬斯亮藍(lán)染色法的廣泛運(yùn)用，近年來就考馬斯亮藍(lán)染色法在提高其靈敏性方面研究者們作了許多改進(jìn)，方法眾多，評(píng)價(jià)不一。

我們?cè)谧麟p向凝膠電泳 時(shí)，將常用的幾種考馬斯亮藍(lán)染色法及銀染進(jìn)行了比較，并就其染色影響因素作出分析。

細(xì)胞總蛋白質(zhì)的提取

取4份經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)的急性早幼粒白血病細(xì)胞株(NB4)1×107細(xì)胞各重懸于350 μl蛋白質(zhì)裂解緩沖液中(8mol/L Urea，2g/L CHAPS，2mmol/L TBP，2ml/L Carrier Ampholyte，痕量溴酚蘭)，置冰浴中超聲裂解，靜置30分鐘，15500×g離心30分鐘，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。

單向定量電泳

取蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物，第1次按1∶2稀釋后，以后按1∶3倍比例逐級(jí)稀釋，經(jīng)4級(jí)稀釋后，取15μl上樣液上樣，β-半乳糖苷酶上樣量依次分別為1μg、 0.24μg、0.062μg、0.0156μg、0.004μg。作12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠單向電泳，同時(shí)電泳4份膠，顯色以確定染色靈敏度。

雙向電泳

取 300μl樣品液沿水化盤中槽的邊緣自左向右線性加入，將17cm IPG膠條膠面朝下置于槽中，靜置45分鐘后覆蓋礦物油，在20℃溶脹11～16小時(shí)。溶脹后的膠條置于等電聚焦盤中，在Protean IEF Cell中進(jìn)行等電聚焦，溫度設(shè)置為20℃，電壓模式設(shè)置為：快速升壓，250 V，0.5小時(shí);500 V，0.5小時(shí);10000 V，60000 Vh(伏特×小時(shí))。

取IEF后的IPG 膠條，先后分別置于含DTT平衡液1(6mol/L urea，2g/L SDS，0.05mol/L Tris pH 8.8，200ml/L gylcecol，2g/L)及含碘乙酰胺平衡液2(同平衡液1，但其中DTT換為2.5g/L 碘乙酰胺)中輕微搖蕩各10分鐘。將平衡好的IPG 膠條置于預(yù)先灌制的12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，封固，在15℃低溫水循環(huán)條件下，15 mA/gel電泳15分鐘，然后以25mA/gel恒流電泳。

顯色

取出SDS-聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)超純水清洗2次，每次1分鐘，4塊膠分別按4種不同的染色方法顯色。下列每步操作皆在搖床上進(jìn)行。4種染色法成份組成及操作如下： ①傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法：清洗后的凝膠經(jīng)固定液(45.4%甲醇、4.6%乙酸)固定1小時(shí)，隨后用染色液(45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBB G250)著色過夜，再經(jīng)洗脫液(5%甲醇、7.5%乙酸)過夜脫色至背景清晰。

②膠體考馬斯亮藍(lán)染色法(colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB)染色法：凝膠先經(jīng)超純水漂洗后，再用colloidal Coomassie blue G250染色液(1.6%磷酸、8%硫酸銨、0.02% CBB G250、20%乙醇)著色過夜，洗脫液為超純水，換液3～4次直至背景清晰。

③改良考馬斯亮藍(lán)染色法(modified Coomassie brilliant blue，mCBB)染色法[6];操作方法同膠體考馬斯亮藍(lán)染色法，只是染色液組成不同(0.12% CBB G250、10%硫酸銨、10%磷酸、20%乙醇)，著色1小時(shí)即可。

④銀染(silver staining)：凝膠漂洗后先被固定液(50%甲醇+ 5%乙酸)固定1小時(shí)，隨后分別用50%甲醇和超純水清洗各10分鐘，0.02 mg/L Na2S2O3 致敏1分鐘，超純水清洗2次，每次1分鐘，再用預(yù)冷的0.15% AgNO3著色20分鐘，超純水再次清洗2次，每次1分鐘，2% Na2CO3 + 0.04% 甲醛顯色20～30秒，當(dāng)溶液變黃以后除去，換新鮮的溶液后繼續(xù)顯色直至顯色適度后，以5%乙酸終止顯色。

成像、分析、質(zhì)譜鑒定

脫色后，凝膠經(jīng)GS-800 Calibrated Densitometer掃描成像，用PDQuest軟件進(jìn)行分析。切取蛋白質(zhì)點(diǎn)，胰酶消化，行質(zhì)譜鑒定。

結(jié)果

4種染色法的蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏性分析

β-半乳糖苷酶的上樣量依次分別為1、0.24、0.062、0.0156和0.004μg。

經(jīng)傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色后的條帶在62ng水平隱隱可見;而膠體考馬斯亮藍(lán)染色法的靈敏度稍高，62ng條帶明顯可見;改良考馬斯亮藍(lán)染色法的效果更好些，在15.6ng水平可見條帶的顯示;而銀染法靈敏度蕞高，在15.6ng水平可見清晰條帶的顯現(xiàn)，同時(shí)在4ng可見隱約條帶。

4種染色法的比較顯示，靈敏度蕞高的是銀染法，可達(dá)納克級(jí)水平，其次為改良考馬斯亮藍(lán)染色法，10納克級(jí)蛋白質(zhì)能被檢測(cè)。而膠體考馬斯亮藍(lán)染色法和經(jīng)典考馬斯亮藍(lán)染色法稍差，檢測(cè)水平僅達(dá)幾十納克。

4種染色法的雙向電泳蛋白質(zhì)點(diǎn)顯示比較

來自NB4細(xì)胞的全蛋白經(jīng)pH 3-10NL的等電點(diǎn)梯度分離，SDS-PAGE 二維垂直電泳后被3種考染法著色成像的顯示可以看出傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色法的蛋白質(zhì)點(diǎn)顯現(xiàn)蕞少，膠體考馬斯亮藍(lán)染色法的蛋白質(zhì)點(diǎn)顯現(xiàn)較多，而改良考馬斯亮藍(lán)染色法的蛋白質(zhì)點(diǎn)顯現(xiàn)更多。

凝膠背景以后二者為更清晰。經(jīng)PDQuest軟件進(jìn)行分析，3幅圖的蛋白質(zhì)點(diǎn)顯現(xiàn)數(shù)分別為483、679、890。NB4細(xì)胞的全蛋白經(jīng)pH 5-8 IPG分離，分別經(jīng)改良考馬斯亮藍(lán)染色法與銀染法著色成像的蛋白點(diǎn)顯示，二者上樣量一致，蛋白點(diǎn)的顯現(xiàn)數(shù)量相當(dāng)，但銀染的蛋白點(diǎn)明顯顯示著色重。這與單向電泳的效果相同。

4種染色法的可操作性比較

在比較其蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏性的同時(shí)，對(duì)染色法的操作簡(jiǎn)便性、安全性以及蛋白質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜鑒定的成功率也作了對(duì)比。比較顯示，考馬斯亮藍(lán)染方法簡(jiǎn)便，但耗時(shí)較長(zhǎng)，經(jīng)改進(jìn)后可以做到無毒操作，質(zhì)譜兼容性較高。

銀染步驟繁多，但耗時(shí)短;操作過程中有甲醇、甲醛等毒性物的接觸，質(zhì)譜兼容性低。即使我們選擇的銀染法被文獻(xiàn)報(bào)道為質(zhì)譜兼容的，但仍然表現(xiàn)為低的蛋白鑒定率，不及考馬斯亮藍(lán)染。