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1.樣本準(zhǔn)備：

1） 收集細(xì)胞。經(jīng)刺激和阻斷處理的細(xì)胞（具體處理方案請參考文獻(xiàn)進(jìn)行），加細(xì)胞染色Buffer（或含0.1%BSA的PBS）制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×107/ml。

2） 取100μl細(xì)胞/管（約1×106細(xì)胞），分別加到做好標(biāo)記的流式管底部。

2.固定：

1） 如需要表面染色，選用適宜抗體進(jìn)行表面染色。

2） 用100uL的1×細(xì)胞固定/破膜液（Fixation/Permeabilization buffer），將流式管中的細(xì)胞重懸，室溫避光孵育30分鐘。

3） 用300g離心5分鐘，棄去上清。

3.破膜：

1） 用2mL的1×細(xì)胞破膜Buffer（Permeabilization Buffer）將固定過的細(xì)胞重懸，300g離心5分鐘，棄去上清。

2）重復(fù)洗一次，300g離心5分鐘，棄去上清。

3） 加入1ml的1×細(xì)胞破膜Buffer（Permeabilization Buffer），4℃避光孵育30分鐘；300g離心5分鐘，棄去上清。

4.胞內(nèi)染色：

1）用100μl 的1×細(xì)胞破膜Buffer（Permeabilization Buffer）重懸細(xì)胞，加入相應(yīng)的抗體，混勻，4℃避光孵育至少30分鐘。

2）加入2ml的1×細(xì)胞破膜Buffer（Permeabilization Buffer）重懸細(xì)胞，300g離心5分鐘，棄去上清。

3）加入2ml的1x細(xì)胞染色Buffer（或含0.1%BSA的PBS）懸起細(xì)胞，300g離心力離心5分鐘，棄去上清。

4）加入0.5ml的1x細(xì)胞染色Buffer（或含0.1%BSA的PBS）重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測和分析。

注意事項(xiàng)：

1. 同一個細(xì)胞同時做細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的蛋白，建議先做細(xì)胞表面染色，再固定、破膜。

2. 細(xì)胞內(nèi)染色推薦使用同型對照。